生物实验报告2500字。

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生物实验报告 篇1

第十次实验分离产淀粉酶微生物

学院：生命科学学院

专业：生物科学类

年级：20xx级

姓名：

学号：1007040085

20xx年XX月XX日

实验十分离产淀粉酶的微生物

一、实验目的

1、熟悉常用微生物培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的配制方法。

2、学习各种无菌操作技术，并用此技术进行为微生物稀释分离、划线分离接种。

3、用平板划线法和稀释涂布平板发分离微生物。

4、认识为微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

5、掌握分离产淀粉酶微生物的试验方法和步骤，了解产淀粉酶的微生物种类及形态。

二、实验原理

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离产淀粉酶的微生物，应该取那些富含产淀粉酶的微生物的土样。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一类型微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有

1、简单单细胞挑取法

2、平板分离法和稀释涂布平板法

此次实验采取的是平板分离法和稀释涂布平板法结合，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括：

1)稀释后的细胞悬液图不在平板上可以分离得单个菌株

2)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

3)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。

以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。

三、实验仪器及试剂

1、器材：

培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、、天平、滤纸、pH试纸等。

2、试剂：

配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、淀粉、卢戈氏碘液、蒸馏水、250ml三角瓶中装90ml无菌水加20粒玻璃珠，作稀释用等。

3、土样：

取自贵州大学农生楼后土壤10g，地下10cm左右。

四、实验步骤：

1、配制牛肉膏蛋白胨培养基：

1）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基400ml（用于11个平皿和7支试管斜面）牛肉膏0.5%…………………………………2g

蛋白胨1%……………………………………4g

NaCl0.5%…………………………………..2g

琼脂2%……………………………………..8g

淀粉0.5%........................................2g

pH……………………………………7.0~7.2

（2）无菌水的制备

分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。

（3）器皿的准备

将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。

2）倒11个平板和7支试管斜面，包扎，0.1Mp、121℃、灭菌30min.

2、制备土壤稀释液：

称取土样10g，放入盛有250ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min使土和水充分混合，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001不同稀释度的土壤溶液。

3、涂布培养：

0.00001、0.000001浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基中，共6个培养基，标号，37°C温箱培养48h。

4、选取目的菌株：

两天后对土壤溶液的微生物培养基进行观察，并取两个菌落形态完全一致的分散的单个菌落，对其中一个喷洒卢戈氏碘液，观察其菌落周围是否出现透明圈，如果出现透明圈说明此菌株产淀粉酶，是目的菌株，记录细菌明显的性状。

生物实验报告 篇2

实验一:练习使用显微镜

目的要求:

1.练习使用显微镜，学会规范的操作方法。

2.能够独立操作显微镜。

3.能够将标本移动到视野中央，并看到清晰的图象。

材料用具:显微镜，写有“上”字的玻片，动、植物玻片标本，擦镜纸，纱布。

方法步骤

1.右手握住镜臂，左手托住镜座。

2．把显微镜放在实验台距边缘7厘米左右处，略偏左。安装好目镜和物镜。

3．动转换器，使低倍物镜对准通光孔。

4．把一个较大的光圈对准通光孔。一只眼注视目镜内，另一只眼睁开。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜可以看到白亮的圆形视野。

5.把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。

6．转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止此时眼睛一定要看着物镜）。

7．一只眼向目镜内看，同时逆时针方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升直到看清物象为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物象更加清晰。

8．练习将所观察的标本移到视野中央，先移动一下标本，物象朝相反的方向移动。说明了在目镜中看到的像是真实的像的倒像。

注意事项

实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。如需擦拭目镜和物镜，请用擦镜纸。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，送回原处。

讨 论

1.显微镜的使用步骤有哪些？

答：1、取镜和安放2、对光3、观察（放片、调焦） 4、清洁与收镜

2.使用显微镜观察时，为什么在下降镜筒时眼睛要注视物镜？

答：物镜把载玻片压碎，也容易划伤物镜。

3.在显微镜下能看清写在不透明纸上的“上”字吗？

答：看不到，不透明的纸会阻挡光线从物镜进入光筒再从目镜射出，所以可能什么也看不见。

实验时间：20xx.9.15

实验二:观察植物细胞

实验目的：

1、制作植物细胞的临时装片,学习制作临时装片的基本办法.

2、认识植物细胞等基本结构. 3、练习画细胞结构图.

实验准备：

分组实验器材：显微镜、洋葱、小刀、清水、滴管、吸水纸、载玻片、盖玻片、镊子、放大镜等。

实验过程：

一、制作洋葱表皮玻片标本

1、用洁净地纱布把载玻片擦拭干净。

2、把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。

制作临时装片

3、用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取一小块透明在膜——内表皮。把撕下的内表皮浸入载玻片的水滴中，用镊子把它展平。

4、用镊子夹起盖玻片，是它的一边先解除4载玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上，这样才能避免盖玻片下面出现气泡而影响观察。

染色

5、把一滴稀碘液滴在盖玻片的一侧。

6、用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。

三、观察洋葱表皮细胞

利用显微镜观察洋葱表皮细胞，先用低倍镜下观察，再在高倍镜下观察。

四、洋葱鳞片叶表皮细胞图。

五、实验结束。

回收实验器材，整理实验桌。

实验时间： 20xx.9.22

实验三：观察人体口腔上皮细胞

目的要求：

1. 制作和观察人体口腔上皮细胞的临时装片

2. 认识人体口腔上皮细胞的结构

3. 熟练画细胞结构图

材料用具：

显微镜、吸水纸、载玻片、盖玻片、生理盐水、碘液、镊子、纱布、漱口杯、牙签 方法步骤

(一) 制作人口腔上皮细胞的临时装片

1. 用纱布擦净载玻片、盖玻片（很薄，应轻擦）

2. 在载玻片中央滴一滴生理盐水（0.9%），说明：为什么用0.9%的生理盐水，观

察洋葱表皮装片用清水，都是为了让细胞所处的环境和它们所生活的环境相同，

不至于胀破或变形，使细胞保持原状。

3. 漱净口。目的：将口腔的饭粒清除，以保证所取的细胞纯度。

4. 用牙签在口腔内壁轻划几下，将上面附有碎屑涂抹在生理盐水中，尽量涂均匀。

5. 盖盖玻片。用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片的水滴，然后慢慢放

平（注意：避免产生气泡）。

6. 染色。①在盖玻片一侧滴加稀碘液，②用吸水纸在盖玻片另一侧吸引，使染液

浸润标本的全部。

(二) 用显微镜观察。

使用显微镜①安放②对光③放置玻片标本，调节焦距，用眼观察，在视野中会看到被染成桔黄色的上皮细胞.

（三）绘图：

人体口腔上皮细胞模式图

（四）整理：清洁玻片，废物放在指定位置。

归纳讨论：人的口腔上皮细胞有哪些基本结构，植物细胞和动物细胞相同和不同之处。 答：人的口腔上皮细胞的基本结构有细胞膜、细胞质和细胞核；植物细胞与动物细胞相比，细胞壁、叶绿体和液泡是植物细胞特有的。

实验时间： 20xx.9.27

实验四：观察人体的基本组织

目的要求：

1．观察人体基本组织的永久切片，认识人体的四种基本组织；

2．描述同一种组织中细胞的共同特点；

3．描述不同组织中细胞形态上的不同之处；

4．根据观察，概述组织的共同特点，形成组织的概念。

材料器具：

显微镜；扁平上皮、立方上皮、柱状上皮等上皮组织玻片；横纹肌、骨骼肌、心肌等肌肉组织玻片；骨、软骨、血液、韧带、肌腱、脂肪等结缔组织玻片；神经组织的玻片。

方法步骤：

1．根据教师提供的玻片，逐个在显微镜低倍镜下认真观察，注意细胞的形态特征和细胞间的联系特点。

2．根据观察，同组间的同学互相讨论，认真填写下表。

主要分布位组织类型 主要特征 功能 举例 置

皮肤，消化 皮肤，小肠腺上皮组织 排列紧密形成表面 保护，分泌 道 上皮

四肢，躯 骨骼肌，平滑肌肉组织 呈长条状紧密排列 干，内脏器 收缩，舒张 肌 官

支持，连接， 软骨，软组结缔组织 细胞之间间隙较大 全身各处 保护，营养 织，血液

产生传导兴神经组织 形状独特呈发散状 神经系统 神经纤维 奋

实验时间：20xx.10.26

实验五：观察叶片结构

目的要求:

1,练习徒手切片.

2认识叶片的结构.

3画叶片的表皮细胞和保卫细胞图.

材料用具:

新鲜叶片,显微镜,双面刀片,镊子,载玻片,盖玻片,叶片的永久切片,盛有清水的培养皿,滴管,吸水纸,碘液,纱布,毛笔,小木板.

方法步骤:

一,练习徒手切片,制作叶片横切片的临时切片

1,把新鲜的叶片平放在小木板上.

2,右手捏紧并排的两片刀片,沿着图中虚线的方向,迅速切割.

3,刀片的夹缝中春游切下的薄片.要多切几次(每且一次，刀片要咱蘸一下税）。把切下的薄片放入水中。

4，用毛笔蘸出最薄的一片，制成临时切片。

二，观察叶片的结构

1用显微镜先观察叶片横切面的临时切片，再观察叶片的永久横切片。

2在显微镜下分清业的表皮，叶肉和叶脉。

三，观察叶片的下表皮

1用镊子撕下一小块叶片（如蚕豆叶片的下表皮，制成临时装片。

2 用显微镜进行观察，看一看叶片下表皮的细胞是什么样子的，下表皮上有没有气孔？下表皮气孔多于上表皮。

四，实验结果。

讨论：保卫细胞和它周围的细胞在结构上有什么不同？保卫细胞的这种结构特点对蒸腾作用有什么意义？

答：当水分充足时,保卫细胞膨胀张开,则气孔张开,这时,蒸腾作用很强；当水分不充足时,保卫细胞收缩关闭,则气孔关闭,这时,蒸腾作用变弱。保卫细胞能够控制气孔开关,所以也就能起到促进或减缓蒸腾作用的意义。

实验时间：20xx.12.5

生物实验报告 篇3

实验教师：xxx

所在学校：xxx中学

目的要求：

1练习徒手切片

2认识叶片的结构

3画叶片的表皮细胞和保卫细胞

材料用具：

新鲜叶片（如菠菜、槐树、蚕豆的叶片），显微镜，双面刀片（两片、并在一起、一侧用胶布粘牢）、镊子、载玻片、盖玻片、叶片的永久切片、盛有清水的培养皿、滴管、吸水纸、碘液、纱布、毛笔、小木板。

方法步骤

方法与步骤要点

注意事项

（一）练习徒手切片，制作叶片横切片的临时切片

1将新鲜的叶片平放在小木板上。

2右手捏紧并排的两片刀片，沿着图中虚线的方向，迅速切割。

3把刀片夹缝中存在的切下的薄片放入盛有清水培养皿中。要多切几次（每切一次，刀片要蘸一下水）。

4用毛笔蘸出最薄的一片，制成临时切片。叶片下面要垫上小块木板，以防损坏桌面。刀片要捏紧，切割速度要快，注意安全。

为了便于观察，载玻片的水滴中可以同时放几片叶的横切片，选择切得最薄的一片用来观察。

（二）观察叶片的结构

1．用显微镜先观察叶片横切面的临时切片，再观察叶片的永久横切片。

2．观察时注意分清时的表皮、叶肉和叶脉。

仔细观察上、下表皮细胞的区别

（三）观察叶片的下表皮

1．用镊子撕下一小块叶片的下表皮，制成临时装片。

2．用显微镜进行观察，下表皮细胞的形态是什么样子的'，下表皮上有没有气孔？

撕取下表皮时，一定要薄，否则影响观察效果。

注意观察气孔的结构。

（四）画图

在下面空白处画出下表皮上一对保卫细胞及周围的几个表皮细胞，这一对保卫细胞要详细画，周围的细胞只需勾出轮廓。

画图时，要真实、实事求是。

讨论与交流

1．保卫细胞的结构特点对植物的蒸腾作用有什么意义？

2．从结构上看，叶片有哪些方面是适于接受阳光的？

生物实验报告 篇4

质粒DNA的提取、纯化及检测

姓名：XXX学号：2011001400XX年级：20xx级生物基地班 实验日期：20xx年9月16日—30日组别：6组 同组者：XX

一、【实验目的】

1、掌握碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒DNA的原理和方法。

2、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

4、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

二、【实验原理】

1、质粒DNA的制备方法

质粒（Plasmid）是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。

2、质粒DNA的提取——碱变性提取法

在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12。0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4。6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀

DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

3、凝胶电泳进行DNA分离纯化

电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA的片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0。1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β—D—吡喃半乳糖与3，6—脱水—L—吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104—105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40—45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DNA（50—20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA的片段，进一步纯化DNA等。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。

三、【实验材料】

1、实验仪器

培养皿、接种环、三角瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1。5ml塑料离心管（Eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、天平、制胶槽、梳子、电泳仪、吸管、量筒、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔、手套等。

2、实验试剂

LB培养基，抗生素Ap（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（EB），DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸钠。

四、【实验步骤】

1、准备实验

配制LB液体培养基，分装到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固体培养基；准备1000ul、200ul、10ul移液枪尖各一盒，1。5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个 ，将上述物品包好连同配好的培养基一同灭菌。

2、菌体培养

在含有Ap的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的E。coli DH5单菌落，接种于20mlLB液体培养基中进行37℃振荡过夜培养，培养基中加Ap100ul

（100ug/ml），质粒pUC19具有Ap抗性基因，使得带有pUC19的质粒得以生长。 过夜培养后菌体量大，杂质较多，然后用移液枪吸取过夜培养物2ml转接于50mlLB液体培养基中，培养基中加入Ap250ul，37℃振荡培养4—6h至对数生长期后期，生长速率快，代谢旺盛，酶系活跃，杂质少，适合提取质粒。

3、质粒提取

（1）称量空的50ml离心管的重量为14。331g，然后将三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒满，液面距管口约1cm，7000rpm离心5分钟后弃去上清液，收集菌体细胞。

（2）向离心管中悬滴加入5ml冰预冷的溶液Ⅰ打散菌体洗涤，用漩涡振荡器使之充分悬浮后用枪尖吹吸混匀，同步骤（1）离心，弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液全部流尽干燥，然后称重得14。437g，则菌体质量为106mg。

（3）洗涤后每100mg菌体应加入冰预冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌体按100mg菌体处理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混匀，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。Tris—Cl溶液提供适当的pH。

（4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（与溶液Ⅰ对应），轻加轻摇，冰浴5min。溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。溶液Ⅱ中的NaOH使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS为下一步沉淀做铺垫。

（5）按比例加入冰预冷的溶液Ⅲ1。5ml（与溶液Ⅰ、Ⅱ对应），轻加轻摇，冰浴10min。溶液出现白色絮状沉淀。沉淀为蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断基因组DNA，只要是50－100 kb大小的片断，就不能再被PDS共沉淀。同时变性的质粒DNA复性。反应形成的高盐环境进一步加速了沉淀。

（6）12000rpm离心15min，白色沉淀聚集在离心管一侧，用移液枪将上清液转移到另一洁净的离心管中。然后向上清液中加入1/10体积的3MNaAc混匀，加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。

（7） 以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，轻轻地覆盖沉淀，不打散沉淀，洗涤一次。

（8）以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。去掉上清液，将离心管上沉淀部位做好标记，将离心管倒置于吸水纸上，干燥5min。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。

（9）将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，移液枪吹吸助溶，然后将溶解液转移到一个Eppendorf管中。TE是pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。

4、质粒纯化

（1）Eppendorf管中加入RNase A（纯浓度＞50ug/ml），37℃保温0。5—1h

（2）将上述的溶液平均分配到2个1。5ml的微量离心管中，每管0。5ml，分别加入与溶液等体积的（500ul）Tris饱和苯酚溶液，振荡混匀，7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中。苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯

酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。

（3）加入等体积的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到到另一洁净的Eppendorf管中。苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但仍有蛋白质的存在。

（4）加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中，得上清液400ul。

（5）向上清液中加入1/10体积的NaAc混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。

（6）以12000rpm，离心15min，弃去上清液，得到DNA沉淀，为白色。

（7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗涤。然后以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。

（8）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。用50ulTE溶解于1管中。

5、质粒检测

（1）称取0。4g的琼脂糖，置于一锥形瓶中，在三角瓶上标好液面位置，加入40ml的1×TAE电泳缓冲液，再加入5—10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至50℃左右，倒入制板槽制板。

（2）待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1×TAE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面2—3cm。取1μl加电泳载样液和3μl质粒样品于小纸片上，用移液枪混匀。

（3）电泳1h，观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。

（4） 把胶槽取出，小心滑出胶块，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约5min。

（5）凝胶成像仪观察。

五、【注意事项】

（1）滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻加轻摇溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，否则会破坏质粒DNA。

（2）加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡， 防止染色体DNA断裂，应该上下颠倒离心管，使其混匀。

生物实验报告 篇5

一、实验目的：

1、掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。2.了解细胞凋亡的生物学意义

3、掌握凋亡细胞的形态学检测方法

二、实验原理：

1、细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。

2、细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。

3、凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。

三、实验步骤：

细胞中过氧化物酶的显示

1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；

2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；

3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；

4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）6、清水冲洗，番红复染2min。

7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）

细胞凋亡的形态学检测与观察吉姆萨染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞3、95%乙醇固定5min

4、PBS缓冲液洗2次

5、吉姆萨染色液染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

7、普通光学显微镜下观察。吖啶橙染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞

3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min4、PBS缓冲液洗2次每次1min

5、0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。

四、结果与分析：

1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100=44.9

Hela细胞凋亡过程中核染色质的形态变化（吖啶橙染色）

五、思考题：

1、细胞凋亡的调控机制

细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。

2、细胞凋亡的特征

凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体。

3、研究细胞凋亡的方法

定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。